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报告总结

治疗视网膜色素变性的基于中空纤维膜 睫状神经营养因子缓释体系研究进展

时间:2019/10/25 17:17:43   作者:R_Han   来源:天马文学网   阅读:14   评论:0
内容摘要:治疗视网膜色素变性的基于中空纤维膜睫状神经营养因子缓释体系研究进展摘要:本文介绍基于中空纤维膜膜的胶囊化细胞的关键技术,并从中空纤维膜、细胞、胶囊化及其工作机理等方面进行了归纳。同时介绍了细胞胶囊治疗遗传性视网膜色素变性从动物模型到临床实验的研究进展。关键词:色素性视网膜变性症、...

治疗视网膜色素变性的基于中空纤维膜

睫状神经营养因子缓释体系研究进展


摘要:本文介绍基于中空纤维膜膜的胶囊化细胞的关键技术,并从中空纤维膜、细胞、胶囊化及其工作机理等方面进行了归纳。同时介绍了细胞胶囊治疗遗传性视网膜色素变性从动物模型到临床实验的研究进展。

关键词:色素性视网膜变性症、中空纤维膜、胶囊化、睫状神经营养因子缓释体系

 

随着人口老龄化的过程,眼科疾病逐渐变得普遍化,常见的有伴随着年龄增长的视网膜病、青光眼、色素性视网膜炎等眼科疾病(Tao, 2006)。色素性视网膜炎(Retinitis Pigmentosa)是一种由于基因变异而引起的遗传性疾病患有视网膜色素变性的患者表现为夜盲、视野偏窄等特点,随着时间的推移视力会逐渐消失。视网膜色素性变性的临床表现从视网膜组织角度来看主要表现是视锥细胞和视细胞退化,并且出现不正常的色素凝块。由于其是遗传性疾病并且视网膜中视锥和视杆神经的结构分布复杂及其处于玻璃体之后位置特殊,目前在临床上还没有行之有效的治疗手段。

缓释神经营养因子(neurotrophic factor)作为一类较好的解决方法能够在理论上有效地促进神经细胞存活和促进神经轴突再生,但是由于视网膜所处的位置在眼睛的玻璃体之后,且睫状神经营养因子是由活体细胞分泌其同时是具有生物活性的蛋白质,因此常用的临床眼科给药手段较难直接有效地治疗色素性视网膜炎。因此能够找到一条持续适量的睫状神经营养因子的药物缓释器件便是较好的治疗视网膜色素变性的方法

一、视网膜组织构成

视网膜位于眼球壁的内层由色素上皮层和视网膜感觉层构成,色素上皮层主要是色素上皮细胞,它具有支持和营养光感受器细胞、遮光、再生和修复等作用。视网膜感觉层由三类神经元构成,它们分别是:①视细胞层,由视感细胞和视锥细胞构成,主要功能是感光。当色素上皮细胞变性后,便不能够营养视锥细胞和视杆细胞层,这就会引起视杆细胞和视锥细胞退化。临床表现的便会是视网膜色素变性疾病。②双节细胞,连接视细胞和神经节细胞主要功能是联系。③节细胞层,主要功能是传导。

二、睫状神经营养因子

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor)是最早发现于鸡胚眼体中间的一类特异性蛋白(Adler et al., 1979)。它在睫状体、虹膜当中都具有较高含量并且可以维持睫状神经元(ciliary neutrons)纤维生存。Barbin1984年从鸡的眼组织中纯化出睫状神经营养因子,这种酸性蛋白分子量为20400 Dalton,等电点为5。实验中发现这种纯化的神经营养因子能够使得分离后的睫状神经节细胞(ciliary ganglion neurons)和从某些小鸡、啮齿类动物体内分离出来的交感神经节细胞(sympathetic ganglia)在体外存活24h以上(Gilles et al., 1984)Masiakowski等人在1991年克隆了位于第11对常染色体11q12上的人CNTF基因,研究发现人类的CNTF基因与大鼠和兔子的有80%的同源性,同时实验证明基因重构后表达的CNTF蛋白和大鼠提取的CNTF蛋白具有相同的生物活性,两者均能够促进从胚胎鸡提取的睫状神经(ciliary neutrons)的存活和其轴突再生(Piotr et al., 1991)

由于睫状神经营养因子具有促进神经细胞存活和轴突再生的生物学功能。它能促使体外培养的感觉神经,运动神经和交感神经的生存。通常对损伤神经通常将睫状神经营养因子作为一种补救因子来进行临床神经治疗。目前研究认为正常啮齿类生物体的CNTF存在于外周神经纤维的雪旺氏细胞内,当神经纤维受损或者神经轴突萎缩时,CNTF被释放出来,从而防止轴突切断后引起的运动神经元的死亡。

三、能够分泌睫状神经营养因子的植入细胞

    生物体当中能够分泌睫状神经营养因子的细胞有常见的雪旺氏细胞。这些细胞具有的共同特点就是处于外周神经周围,分泌CNTF保护外周神经。近年来通过细胞微囊化进行移植。常见的有两类方式,一类是直接将自体细胞经过体外培养再进行移植,另一类是通过将异体细胞微囊化来进行移植。

 3.1 自体雪旺氏细胞

雪旺氏细胞是外周神经的胶质细胞,包绕外周神经轴。外周神经损伤后,雪旺氏细胞从神经两端迁移形成髓鞘,通过影像实验计算得到神经突再生过程有两个阶段,第一阶段为慢速生长77 μm/day,第二阶段为快速生长283 μm/day。此外实验还发现再生神经轴突的影像表明,神经轴突生长较长的样本表面雪旺氏细胞含量丰富。(Torigoe et al., 1996)当损伤神经段发生Wallerian 变性脱髓鞘巨噬细胞在损伤区大量聚集、吞噬,雪旺氏细胞功能发生改变,从维持髓鞘结构及轴突完整的结构细胞转变为再生支持细胞损伤远端的雪旺氏细胞很快增殖形成Bungner,再生轴突沿Bungner带生长,实验证明雪旺氏细胞为轴突再生提供了有利的微环境,对神经再生有重要作用。雪旺氏来源于胚胎时期的神经嵴细胞,具有以下三种功能:①可以通过促进基底膜产生促进神经细胞轴突再生的细胞外基质,如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白。②增加细胞表面粘附分子的合成,如神经胶质细胞粘附分子,神经细胞粘附分子。这些粘附分子能够和雪旺氏细胞产生的细胞外基质和神经营养因子共同促进神经元轴突再生。③产生CNTF及其受体,促进外周神经的再生和功能恢复(李陶 et al., 2001)

3.2基因转染后的菌类和异体细胞

Michael R. Hoane等人比较研究了哺乳动物细胞和埃氏大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的神经营养因子配体NTNNeurturin)。将两种NTN用在体内的多巴胺能神经元实验中,结果就证明用哺乳动物细胞的rh-NTN同埃氏大肠杆菌的比较更具生物活性优势(Hoane et al., 2000)综合Lindner MD(MD et al., 1996)等人早期的研究, ECT微囊化的过程选用基因转染后的哺乳动物细胞比埃氏大肠杆菌类分泌的活性蛋白更具生物活性优势。因此在转基因细胞的选择上,NTC-201采用源自于人视网膜的NTC-200细胞,并将CNTF基因转染到这类细胞的质粒中(Tao et al., 2002)

四、Encapsulated cell treatment (ECT)技术

4.1 细胞移植中的免疫排斥反应

细胞基因转染技术的快速发展,能够将高效而稳定表达的细胞株进行临床使用具有重要的医学价值。然而绝大多数高效稳定表达的细胞株来源于异体或者异种,临床植入生物体内后具有较强的抗原性,会引起宿主免疫系统的排斥反应。在临床上通常使用组织配型,免疫抑制剂来克服免疫排斥反应,然而免疫抑制剂的使用通常具有较强的副作用。

4.2 免疫隔离技术(Immunoisolation

为了克服细胞移植中的免疫排斥反应,近年来逐渐发展起来的免疫隔离技术逐渐被应用到临床研究上。免疫隔离技术是首次被Sun AM在链唑霉素诱导糖尿病streptozotocin-induced diabetes大鼠模型上成功使用(Lim and Sun, 1980)这种方法从理论上解决了细胞移植物的免疫排斥问题,这种技术使用具有生物相容性的半透膜,将容易引起免疫排斥反应的活体细胞包覆。半透膜包覆的微囊为细胞的生长和代谢提供营养物质和排泄代谢产物。常见的半透膜通常包括渗透性小腔,微囊和中空纤维膜。免疫隔离技术的原理就是将宿主体内的大分子量的抗体和巨噬细胞用半透膜隔离在细胞胶囊外。早在上世纪六十年代TMS Chang的研究也提出将细胞包覆起来,他1964年将蛋白溶液用聚合物半透膜封装(Chang, 1964)1965年首次提出人工细胞的概念(Chang, 1965)。将具有生物活性的细胞通过半透膜包覆,这些半透膜能够将抗体隔离,活细胞分泌的小分子量蛋白,多糖能够通过半透膜扩散到植入宿主当中。

五、中空纤维膜构成的细胞微囊

5.1中空纤维膜

中空纤维膜是用于净水和分离的一类半透膜,主要在工业上用做分离蛋白质、细菌。常见的中空纤维膜材质主要是聚醚砜树脂(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)等。由于聚醚砜树脂良好的性质及其为美国FDA认证且符合日本厚生省第434178号公告。微囊化细胞所选用的材质为聚醚砜树脂。纺制中空纤维膜的过程是将聚醚砜树脂(PES)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和增塑剂(Plasticizer)溶入到强极性有机溶剂当中(例如,DMFDMAcDMSO),并从管式喷丝头中挤压出来,浸入到周围的浴液中。经过相反转过程,便形成支撑层和表皮层结构的中空纤维膜。Hal Wood 等人实验证明在PES适合浓度约为22%-24%左右可以纺出较好的中空纤维膜,当超过26%的临界浓度时便不能纺出较好的中空纤维膜(Wood et al., 1993)Hwang Rong Rim等人的研究证明PVP作为造孔添加剂改变了膜表面孔的数目,并不改变超滤膜表面分离层孔径的大小(Jeong Rim et al., 1996)Ani Idris等人则采用不同分子量的PEG作为添加剂来制备平板超滤膜,通过采用PEG200PEG400PEG600为添加剂,DMF为溶剂制备的平板膜的分子截留率MWCOmolecular weight cut off)从26KD增至45KD(Idris et al., 2007)A. Rahimpour等人在文献中报道了利用合成的Poly(sulfoxide-amide)PSA)亲水性分子做为添加剂利用相反转方法制备出了表面孔径约20nmPES平板膜(Rahimpour et al., 2009)。分离层表面孔径处于10-20nm范围的膜便能够起到氧气和营养物质扩散、睫状神经营养因子的分离扩散,巨噬细胞和抗体的隔离作用。

5.2微囊器件及其工作机理

Paul A. Sieving等人(Sieving et al., 2006)在动物模型实验和临床一期实验上用中空纤维膜和转基因细胞所构成的产品Neurotech公司的NTC-201(Tao et al., 2002)NT-501(Sieving et al., 2006)来治疗视网膜神经节细胞轴突衰竭。NTC-201,NT-501均由表面滤层为15nm孔径的PES材质的中空纤维膜来进行睫状神经营养因子的分离和筛选,这种半透膜结构能够很好的为转基因细胞提供免疫隔离环境,分子量≧150KD的抗体不能够渗透到胶囊里面,同时又能够使得睫状神经营养因子(~30KD)顺利扩散到隔离胶囊外面。Christopher G. Thanos(Thanos et al., 2004)等人研究了两类基因工程细胞系在NT-501的分泌情况。实验将种细胞微囊植入兔子眼中1, 3, 7, 14, 30, 60, 90, 135, 180, 365 从玻璃体当中取出之后,37°C进行体外培养24h,再用ELISA进行CNTF蛋白分泌量的分析。实验中低剂量的微囊能够持续分泌6个月,其半衰期是71天。高剂量的微囊能够持续分泌1年,半衰期是198天。这就说明他们研究小组的ECT控释体系能够成功的分泌睫状神经营养因子。

六、ECT缓释睫状神经营养因子在视网膜色素变性治疗研究进展

细胞微囊技术(ECT)能够可控持续的将蛋白缓释到眼睛病变部位,此外这种技术还能够在一定时期将ECT微囊从眼睛中取出,这就增加了植入到体内的安全性,目前睫状神经营养因子能够保护13种动物模型的视网膜,还有能够起到保护有色素性视网膜炎rcd1犬模型(Tao, 2006)

6.1 临床前动物实验

Weng Tao等人(Tao et al., 2002)研究了基于细胞微囊治疗技术的缓释CNTF治疗视网膜色素变性的动物实验。该实验采用犬齿科视网膜色素变性动物模型,实验中选用的动物为视网膜正在衰退但未完全衰退rcd1狗。将NTC-201植入动物模型玻璃体内7周之后发现,每个动物样本的植入眼睛同未植入NTC-201的眼睛比较,植入后的眼睛在外核层(outer nuclear layer)的感光核(photoreceptor nuclei)数量明显要高。同时在7周动物实验结束后,发现感光核的数量和NTC-201的缓释CNTF具有数量依赖关系,缓释CNTF含量高的模型其感光核数量明显要高。这就说明睫状神经营养因子直接缓释到PDE6B缺损的rcd1动物模型的玻璃体当中并且通过扩散的作用达到视网膜病变部位。综合这些研究结果就说明基于细胞微囊治疗技术的缓释蛋白能够作为治疗视网膜内的神经性疾病的一条有效途径。

Ronald A. Busb等人(Bush et al., 2004)以新西兰大白兔作为动物模型,将中空纤维膜封装的可分泌睫状神经营养因子的哺乳动物细胞植入到会玻璃体中。实验证明通过ECT方式(5ng/d)给药能够保护视网膜衰退动物模型,同时不会影响ERG测试的视感细胞和视锥细胞,以及正常的视网膜功能。当ECT每天分泌22ng/dCNTF,视锥细胞的ERG检测表明细胞对刺激抑制的敏感性降低。因为这些试验结果并不会引起视杆细胞的ERG测试的大范围缺陷,所以这种睫状神经营养因子的给药量依赖关系对ONL和光感受细胞核并不具有细胞毒性。

耶鲁大学医学院的Zeiss CJ等人(Zeiss et al., 2006)研究了睫状神经营养因子缓释对啮齿类动物的正常视网膜和患病视网膜的影响。实验结果证明睫状神经营养因子对患有色素性视网膜炎疾病的几类啮齿类动物的杆状视网膜细胞形态学具有保护作用。然而睫状神经营养因子缓释微囊的体内植入又对感光层的形貌和杆状感光细胞的分化产生影响,同时也对正常细胞的电生理学形态产生影响。

综合前期的模型动物临床实验来看,睫状神经营养因子对于遗传性疾病(亨廷顿疾病(Emerich et al., 1996, Emerich et al., 1997)、视网膜色素变性(Tao et al., 2002, Bush et al., 2004))的动物模型的治疗效果还是突出。特别是在视网膜色素变性的rcd1犬、新西兰大白兔、的效果更为良好,这就为微囊化细胞的临床实验提供理论支持。由于视网膜色素变性的病变位置在于眼玻璃体后方的视网膜上,因此它的临床治疗途径要比亨廷顿疾病的临床实验要容易,且临床效果更容易判定。

6.2 临床医学实验

Paul A Sieving(Sieving et al., 2006)等人在Neurotech公司利用聚醚砜(PES)树脂基半透膜胶囊化的视网膜细胞植入到患者的玻璃体当中进行临床一期实验。实验效果并不是完全的能够充分证明NT-501的临床效果,但是十名患者样本当中的七人能够利用视力评测表进行临床结果分析。其中的三人的临床效果表现在视力改善到能够看到更进一步的10-15个字符,也就是在临床上的标准视力表(Snellen acuity charts)检测提高两到三行。这些实验结果证明睫状神经营养因子在临床上对人视网膜是安全可靠的,即使是较深度的视网膜感光系统衰退。同时这种基于ECT治疗的半透膜微囊技术能够在基因突变所致疾病的治疗上得到应用。

七、前景展望

目前Neurotech公司组织的临床二期试验已经完成,临床三期正在进行,相信不久的将来,这种基于ECT技术的睫状神经营养因子治疗方式将会在视网膜病、青光眼、色素性视网膜炎等遗传性疾病的治疗方面取得较大的突破。

 


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